摘要 基因治療在基礎及臨床研究方面都取得了很大進展，目前基因治療應用于動物肝移植的實驗研究已經(jīng)具有可行性，正應用于研究移植物排異反應的機制，并有可能成為誘導免疫耐受的有效方法，對供肝或受者進行基因治療有望在減少急慢性排異反應、提高移植肝的存活時間等方面取得突破。
 
　　肝移植術(shù)后全身免疫抑制劑的應用將導致受者易于發(fā)生感染，腫瘤的發(fā)生率也顯著增加，尚存在腎毒性等副作用[1]�；�因治療所誘導的免疫抑制只發(fā)生在移植肝的局部或具有供者特異性，對全身免疫功能影響較小。轉(zhuǎn)導基因所編碼的蛋白質(zhì)能在肝內(nèi)持續(xù)表達。一種轉(zhuǎn)導的基因只編碼一種蛋白質(zhì)，這為研究各種物質(zhì)在移植免疫方面的作用提供了可能性。另外，基因治療能在低溫下進行，不影響離體肝的功能[2]。肝移植的基因治療實驗研究的主要焦點是主要組織相容性復合物（MHC）和影響排異反應的各種細胞因子。

　　1肝移植基因治療的載體

　　1.1復制缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

　　采用復制缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導基因具有構(gòu)建簡單、能有效插入宿主基因組、病毒不復制和可持續(xù)表達等優(yōu)點，但它只能在細胞處于分裂期才能將基因整合入細胞染色體。Abraham等在對供肝大鼠行半肝切除24小時后切取供肝，以誘發(fā)肝細胞增殖，再用含有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的保存液低溫灌注供肝，然后行原位肝移植術(shù)，發(fā)現(xiàn)所攜帶的目的基因持續(xù)表達至術(shù)后21天，轉(zhuǎn)導效率為1%~3%[3]。因為臨床上誘導供肝細胞增殖的可能性較小，所以它的應用受到限制。

　　1.2復制缺陷性腺病毒載體

　　已構(gòu)建好的復制缺陷性腺病毒載體一般缺少整個E1a和部分E1b基因，需生長在含有Ad5的E1區(qū)的293細胞中，而不能在不表達E1功能的細胞中復制。它能有效地轉(zhuǎn)導入靜息細胞，而不受細胞周期的影響。另外，它還能在低溫下有效地轉(zhuǎn)導肝細胞，這正符合移植肝的保存條件[4]。腺病毒載體不整合入細胞染色體，因而插入突變的可能性也大大減少，但此特性亦導致腺病毒似乎不能在細胞內(nèi)長期存在。Abraham等用含有腺病毒載體的保存液低溫灌注離體供肝1小時，然后行原位肝移植術(shù)，所攜帶的目的基因所表達的重組蛋白在術(shù)后24小時至7天均可檢測到，轉(zhuǎn)導效率為10%~15%[5]。另有研究表明，轉(zhuǎn)導效率與病毒/肝細胞比率及轉(zhuǎn)導時間直接有關(guān)[6]。

　　1.3質(zhì)粒DNA

　　有報道，應用質(zhì)粒DNA攜帶目的基因轉(zhuǎn)導肝細胞[7]，或攜帶MHC基因直接注射入受者胸腺組織，檢測到MHC基因在胸腺組織的表達[8]。

　　2肝移植基因治療的轉(zhuǎn)導方法

　　2.1間接轉(zhuǎn)導法

　　將目的基因在體外轉(zhuǎn)導入原代培養(yǎng)的細胞（如肝細胞或肌細胞），然后將靶細胞再轉(zhuǎn)入組織或器官（如肝臟和胸腺等）。將目的基因轉(zhuǎn)導入培養(yǎng)細胞的方法有很多，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導法、脂質(zhì)體介導法、磷酸鈣沉淀法和電穿擊法等。

　　2.2直接轉(zhuǎn)導法

　　即不將目的基因在體外轉(zhuǎn)導入原代培養(yǎng)的靶細胞，而將目的基因直接轉(zhuǎn)導入肝組織的方法，包括復制缺陷性腺病毒載體灌注供肝、肝內(nèi)注射法、顆粒轟擊法及門靜脈注射法等。

　　3肝移植基因治療的目的基因

　　3.1主要組織相容性復合物

　　對自身MHC抗原的免疫耐受是通過將其遞呈給未成熟胸腺細胞而使對此抗原有反應的胸腺細胞發(fā)生凋亡后而獲得，外源性抗原也可通過此途徑獲得免疫耐受。Knechtle等先轉(zhuǎn)導入受者的肌細胞，然后再將肌細胞注射入受者胸腺組織，并同時皮下注射抗淋巴細胞血清，3周后行異種原位肝移植，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導后的受者肌細胞能表達供者的MHC抗原，基因治療組大鼠的存活時間顯著延長，受者的CTL細胞對供者細胞的殺傷力下降至1/10，這種移植物耐受性具有供者特異性[9]。同一小組的研究表明，將含有供肝大鼠種系Ⅰ類MHC的質(zhì)粒DNA直接注射入受者胸腺組織，并同時皮下注射抗淋巴細胞血清，可以觀察到受者胸腺細胞表達供者MHC抗原，7~10天后行異種原位肝移植，13只中有9只存活100天以上。這一供者特異性移植物耐受的產(chǎn)生，可能與對供者的MHC抗原有反應的T細胞克隆的去除及抑制性淋巴細胞的產(chǎn)生有關(guān)[8]。

　　3.2細胞因子

　　異體器官移植排異反應與受者的細胞因子網(wǎng)絡密切相關(guān)，有較多研究表明，Th1細胞因子如干擾素（IFN）、白介素（IL）-2等參與器官移植排異反應，而Th2細胞因子對IL-4、IL-10等可以抑制Th1細胞因子的釋放，因而抑制Th1細胞因子的分泌、增強局部或系統(tǒng)Th2細胞因子的水平將有助于減少排異反應的發(fā)生[10]。David等將Th2細胞因子IL-4、IL-10的基因轉(zhuǎn)導入移植肝，認為這是上調(diào)移植肝局部的免疫抑制的可行方法[11]。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1能抑制細胞免疫功能，能顯著抑制CTL和NK細胞的活性，并能延長移植物的存活時間。Kenneth等將含有TGF-β1 cDNA的腺病毒轉(zhuǎn)導入移植肝，采用RT-PCR可以在術(shù)后1~5天探測到TGF-β1 mRNA在移植肝內(nèi)的表達，TGF-β1的增高是與局部腫瘤壞死因子（TNF）-α和INF-γ的下降密切相關(guān)，而后者可能與誘發(fā)器官移植排異反應有關(guān)[12]。

　　3.3反義核酸和反義核酸酶

　　在異種移植中抑制或敲除編碼主要異種抗原Gal的α（1,3）半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因能夠抑制超急排異反應，Hayashi采用針對這種基因的反義核酸酶轉(zhuǎn)導豬和小鼠，發(fā)現(xiàn)Gal的表達下降。他們認為在異種移植中除了轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)外，腺病毒基因轉(zhuǎn)導技術(shù)也有望抑制超急排異反應的發(fā)生和發(fā)展[13]。

　　4存在的問題和前景展望

　　基因治療在肝移植中的應用尚處于實驗階段，此療法付諸臨床試驗還為時過早，因為治療本身尚有很多問題亟待解決。如（1）目前轉(zhuǎn)導技術(shù)基因表達率相對較低；（2）目的基因表達時間相對過短；（3）為了延長目的基因表達時間，有必要反復轉(zhuǎn)導病毒載體，但是機體可能對此載體產(chǎn)生免疫反應，從而限制了病毒載體的再次應用[14]；（4）對于MHC抗原的合適形式、定位和劑量等尚缺乏很好的理解；（5）尚未明確器官移植排異反應過程中各種細胞因子的作用及相互關(guān)系。隨著基因治療技術(shù)的成熟，可能會發(fā)現(xiàn)一種更有效、安全及能長期表達的載體或轉(zhuǎn)導技術(shù)，對器官移植排異反應機制的深入研究，將有助于對MHC及細胞因子網(wǎng)絡的理解�；�于基因治療在肝移植中的應用有諸多優(yōu)點，將具有廣闊的前景。